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작성일 : 21-07-05 14:50
나노바디를 통한 항체 생성
 글쓴이 : biostem
조회 : 171  

 낙타와 라마(llama) 등이 만드는 항체는 나노바디(nanobody)라는 조그만 단백질 영역(protein domain)을 이용하여 표적에 결합한다. 
이제 형질전환된 생쥐가, 기존의 항체보다 COVID-19를 더 효과적으로 치료하는 나노바디를 생산하는 것으로 밝혀졌다.
 
▶ SARS-CoV-2 변이주의 등장은 COVID-19 팬데믹을 통제하려는 노력에 어떤 영향을 미칠까? 
그런 변이주들이 제기하는 위협은 (코로나바이러스의 진화와 싸우기 위한) 백신 및 치료제 개발에 주의를 집중시키고 있다. 
이와 관련하여, 미국국립보건원(NIH) 산하 NIAMS의 림프구핵생물학팀(Lymphocyte Nuclear Biology)의 쉬젠량(徐建良) 등은 
지난 6월 《Nature》에 실린 논문에서(참고 1) "낙타과 동물(예: 낙타와 라마)이 생성하는 것과 비슷한 항체를 만드는 형질전환 생쥐를 개발했다"고 발표했다. 
그 항체는 VHH(variable heavy chain domains of heavy chain antibody) 또는 
나노바디(nanobody)라고 불리는 단일·소분자단백질 영역(single, small protein domain)을 이용하여 표적을 인식하는데, 
徐 등이 형질전환 생쥐에게 SARS-CoV-2의 스파이크 단백질에 기반한 단백질을 접종했더니, 항바이러스 나노바디(antiviral nanobody)를 만들었다고 한다. 
그들에 의하면, 이 나노바디는 (현재 개발되고 있는 수많은 전통적 항체에 저항하는) 변이 바이러스를 무찌르는 포맷으로도 생산될 수 있다고 한다.
 
인간과 생쥐가 만드는 전통적 항체들은 두 개의 가변영역(VH와 VL)을 이용하여 항원(antigen: 질병을 초래하는 단백질 단편)을 인식하는데,
이 영역들은 별도의 중쇄(heavy-chain)와 경쇄(light-chain) 단백질로 구성되어 있다. 그와 대조적으로, 낙타과 동물과 연골어류(예: 상어)는
「중쇄만 있는 항체(heavy-chain-only antibody)」를 만들 수 있는데, 이것은 「단일한 가변적 VHH 영역을 가진 항체」(또는 나노바디)를 이용하여 항원을 인식한다. 
나노바디의 한 가지 이점은 '작은 크기'에 있는데, 그것은 나노바디로 하여금 조직을 관통하여 (전통적인 항체가 통상적으로 접근할 수 없는)
에피토프(epitope: 항체와 결합하는 항원 영역)를 인식하게 한다.
 

☞ SARS-CoV-2를 겨냥하는 다양한 유형의 항체들

a. 전통적 항체(conventional antibody)
인간과 생쥐의 항체는 별도의 경쇄(light chain)와 중쇄(heavy chain) 단백질에 존재하는 두 개의 가변영역(VH와 VL)을 이용하여 표적에 결합한다. 
경쇄와 중쇄는 '경쇄의 CL 영역'과 '중쇄의 CH1 영역' 간의 연결을 통해 짝을 이룬다. 이렇게 짝지어진 영역들은 중쇄와 경쇄의 불변영역(constant region)의 일부다. 
중쇄의 불변영역은 두 개의 다른 영역(CH2와 CH3)—이것들은 Fc 영역(Fc domain)이라는 것을 형성한다—으로 구성되는데, 
Fc 영역은 항체가 전신을 돌아다니며 면역계의 다른 구성요소들과 상호작용하도록 도와준다.

b. 중쇄만 있는 나노바디를 포함한 항체(Heavy-chain-only nanobody-containing antibody)
낙타과 동물들(예: 낙타, 라마)은 중쇄 하나만 포함한 항체를 만들 수 있다. 왜냐하면 그들의 유전자 중 일부가 'CH1 영역이 결핍된 중쇄 단백질'을 코딩하기 때문이다. 
이러한 항체들은 하나의 가변영역(VHH: variable heavy chain domains of heavy chain)를 이용하여 표적을 인식하는데, 
VHH를 나노바디(nanobody)라고도 한다. 쉬젠량(徐建良) 등은 나노바디와 비슷한 유형의 항체를 만드는 형질전환 생쥐를 개발했다.

c. 가공된 나노바디를 포함한 항체(engineered nanobody-containing antibody)
徐 등은 생쥐의 유전자를 변형하여, '3개의 나란한 낙타의 나노바디 사본을 포함한 중쇄'와 '인간의 Fc 영역'으로 구성된 항체를 만들게 만들었다.
그들은 《Nature》에 실린 논문에서, 생쥐가 만든 항체—이름하여 「중화 나노바디」(naturalizing nanobody)—는 
in vitro에서 SARS-CoV-2가 인간세포를 감염시키지 못하도록 막았으며, 2차 및 3차 팩데믹 때 등장한 우려되는 
SARS-CoV-2 변이주(SARS-CoV-2 variant of concern)를 초과적으로 차단했다고 보고했다.

일반적인 나노바디는 극단적으로 안정적(stable)이고 수용성(soluble)이며, 그 모듈적 속성(modular nature)을 감안할 때 단독으로 
또는 다양한 포맷(이를테면, 방어력을 증강시키는 인간항체의 Fc 영역과 융합됨)으로 발현될 수 있는 것으로 보인다. 
이러한 특징은 나노바디 기반 치료법(nanobody-based therapeutics)을 전통적인 
단클론항체(특별한 아미노산 시퀀스와 항원특이성을 가진 중쇄와 경쇄로 이루어진 항체)의 유망한 대안으로 부각시킨다. 
그러나 현실은 아직 초라하기 짝이 없다. 2021년에 100번째 단클론항체 치료법이 규제당국의 승인을 받았음에도 불구하고,
FDA로부터 임상적 사용을 승인받은 「나노바디 기반 치료제」는 달랑 하나뿐이니 말이다(참고 4).

현재, COVID-19 치료제로의 개발이 진척된 단클론항체는 중화항체(바이러스의 침입을 차단하는 항체)라는 전형적인 유형의 항체밖에 없다.
대부분의 중화항체는 1차 팬데믹 때 감염됐던 사람들의 항체생성세포에서 추출된 것이다.
그런 항체들은 스파이크 단백질의 수용체 결합영역(RBD: receptor-binding domain)을 겨냥하는데, 
바이러스는 이 영역을 이용하여 (세포 감염을 가능케 하는) 수용체에 결합한다. 인간 단클론항체는 임상개발에서 강력히 선호되는데, 
그 이유는 고도로 특이적이고, 쉽게 생산될 수 있고, 인간의 면역계와 잘 협동하며, 면역계의 전폭적인 관용을 기대할 수 있기 때문이다.
그러나 "SARS-CoV-2와 같이 진화하는 인간호흡기바이러스에 대응하여, 대안적 「나노바디 기반 치료제」를 개발해야 한다"라는 주장이 힘을 얻고 있다.

▶ 돌이켜 보면, SARS-CoV-2가 인간을 감염시키기 시작한지도 어언 1년이 넘었다. 
그 동안 SARS-CoV-2에 대항하여 가동된 집단적 인간 중화항체 반응은 스파이크 단백질의 RBD에 강력한 선택압(selection pressure)을 행사했다. 
그 결과, 2차 및 3차 팬데믹 기간 동안 지배적이었던 바이러스 버전의 2~3개 아미노산 잔기 변화는 '1차 팬데믹 기간 동안
생성된 항체에 의한 중화'에 더욱 강력히 저항하는 버전을 탄생시키기에 충분했다. 
이것은 COVID-19에서 회복한 사람들에게서 채취한 혈액 샘플─회복기혈청(convalescent serum)─을 이용한 검사에서 이미 밝혀진 사실이다.

그렇다면 1차 팬데믹 기간 동안 작동한 항체반응에서 채굴한 단클론항체 요법은 신속히 무용지물이 되었다는 결론이 나온다. 
그러나 중화항체에 의해 인식되는 스파이크 단백질의 RBD에서 (인간항체에 의한 에피토프 인식의 결과물로서의) 선택압에 직면하지 않은 부분이 있다면, 
그것의 에피토프는 대안적 항체(바이러스 변이주가 등장하더라도 신속히 무효화되지 않는 COVID-19용 항체)를 제공할 수 있다. 
이번에 徐 등이 개발한 「중화 나노바디(neutralizing nanobody)」가 바로 그것이다. 광범위한 「중화 나노바디」—
진화적으로 보존된 스파이크 단백질의 에피토프를 인식하는 나노바디—는 심지어 (미래의 팬데믹을 추동할 능력을 보유한) 다른 코로나바이러스에도 유용할 수 있다.

크기가 '작고' '수용성(水溶性)'이라는 나노바디의 속성은, 저렴하게 생산할 수 있고
「흡입에 의한 직접 투여(administer directly by inhalation)」를 통해 
기도(respiratory tract)의 핵심 부위—바이러스가 복제하는 곳—를 쉽게 겨냥할 수 있음을 의미한다. 
SARS-CoV-2를 겨냥하는 「중화 나노바디」의 비강분무(intranasal aerosol delivery)를 평가한 동물연구에서,
나노바디는 동물(햄스터)의 기도 전체에 효과적으로 축적되었으며, 바이러스의 수준을 두드러지게 감소시켰다는 결과가 나왔다. 
급성 감염 환자에게 짧은 기간 동안 단 한 번 투여하는 한, 나노바디가 강력한 면역반응에 직면하여 무효화되는 일은 없을 것이다. 
그런 우려(면역계의 외부항체 공격)는 장기간에 걸쳐 반복적인 투여를 요하는 중증환자를 치료하기 위해 개발된 단클론항체에 해당되는 이슈다.

▶ 나노바디의 임상 적용이 약간 망설여지고 있지만, 많은 연구에서 "스파이크 단백질에 기반한 SARS-CoV-2 백신을 이용하여, 
낙타과 동물에서 강력한 「중화 나노바디」 생성을 유도할 수 있다"라는 결과가 나왔다.
徐 등은 한걸음 더 나아가, 중쇄만 보유한 항체(heavy-chain-only antibody)를 생산하는 나노생쥐(nanomouse)를 만드는 방법을 제시했다. 
그 접근방법은 나노바디를 지금껏 가능했던 것보다 더 쉽고·빠르고·저렴하게 생산하는 시스템을 제공한다. 생쥐를 사육하는 연구실 장비는 저렴하고 보편적이며,
생쥐의 면역계는 잘 이해되어 있으며, 고품질 도구(예: 세포를 분류하는 데 필요한 장비)는 쉽게 구할 수 있기 때문이다.
더욱이 생쥐의 면역화는 대형동물 모델보다 훨씬 빨리 일어날 수 있는데, 이는 새로운 팬데믹에 대한 신속한 대응이 요구될 때 중요한 고려사항이다.

이러한 나노생쥐를 개발하기 위해, 徐 등은 유전체 DNA의 커다란 영역(생쥐의 모든 V 중쇄 유전자 포함)을 
알파카와 낙타(Dromedary, Bactrian)에서 유래한 30개의 V 중쇄 유전자(heavy-chain V gene)로 구성된 DNA 영역으로 교체했다. 
각각의 유전자는 하나의 DNA 시퀀스와 융합되었는데, 그 시퀀스는 유전자로 하여금 (VDJ 재조합 과정을 통해) 
생쥐의 중쇄의 D 및 J 유전자—V, D, J는 각각 variability, diversity, joining의 이니셜이다—와 정상적으로 연결되어 완벽한 VHH 유전자를 만들게 해 주었다.
또한 V 유전자는 프로모터 DNA 시퀀스와 융합되어, VHH 유전자가 생쥐의 항체생성 B세포에서 발현될 수 있게 되었다. 
그 결과 발생한 B세포들은 낙타의 V, 생쥐의 D, 생쥐의 J 유전자를 재조합함으로써, 
'이질적 VHH 유전자 시퀀스'를 '장쇄만 있는 항체'로 발현하는 B세포 집단을 형성하게 되었다. 
In vitro 실험에서, 이러한 B세포들은 면역화에 정상적으로 반응하여 친화력 성숙(affinity maturation) 과정을 거쳐, 
맞닥뜨린 항원에 대응하여 생성된 항체의 효능(potency)과 특이성(specificity)을 향상시키는 것으로 밝혀졌다.
 
다음으로, 徐 등은 3마리의 나노생쥐와 한 마리의 라마에게 SARS-CoV-2의 스파이크 단백질과 RBD를 접종했다. 
그 결과 두 가지 동물모델 모두에서 「중화 나노바디」가 검출되었다. 이러한 「중화 나노바디」는 
하나의 인간항체의 Fc 영역과 융합된 3개의 나란한 나노바디 사본(three tandem nanobody copies)으로 발현되도록 포매팅될 수 있다.
Fc 영역은 전통적인 항체의 핵심 특징으로, 항체로 하여금 전신을 돌아다니게 하고, 항체의 수명을 연장하며, 면역계의 다른 구성요소들과의 상호작용을 증가시킨다.
나란한 나노바디를 이용한 포맷은 항체와 항원의 결합을 강화하는 데 도움이 된다. 저자들이 제시한 증거가 시사하는 것은, 
이렇게 가공된 항체가 테스트에 사용된 모든 우려되는 SARS-CoV-2 변이주들—2차 및 3차 팩데믹 때 등장한 우려되는 
SARS-CoV-2 변이주(SARS-CoV-2 variant of concern)—을 강력히 중화시킨다는 것이다. 한걸음 더 나아가, 
나노생쥐가 생산한 나노바디들은 RBD상에 존재하는 '진화적으로 보존된 에피토프'—인간의 항체가 흔히 인식하는 영역과 겹치지 않는 부분—를 인식하는 것으로 나타났다.

COVID-19 팬데믹은 나노바디가 임상에서 빛을 발할 수 있는 독특한 기회를 제공하며, 
나노바디 플랫폼은 고품질 치료용 나노바디 옵션(higher-quality therapeutic-nanobody option)을 제시함으로써 
팬데믹 극복의 가능성을 한층 더 높일 것으로 기대된다. 
인간의 변이영역을 포함하는 항체를 가진 생쥐(예: 리제네론의 VelocImmune 생쥐)가 
100번째로 FDA의 승인을 받은 단클론항체의 탄생에 밑거름이 된 것처럼, 나노마우스는 「나노바디 기반 치료법」을 동일한 방향으로 이끄는 견인차가 될 것으로 기대된다.